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蛋白表達(dá)的常見(jiàn)問(wèn)題

蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)的時(shí)，有時(shí)候?qū)嶒?yàn)會(huì)覺(jué)得參考實(shí)驗(yàn)方法和克隆的蛋白基因序列完q沒(méi)有問(wèn)題，但蛋白電泳就是沒(méi)有結(jié)果。那么你知道蛋白表達(dá)的常見(jiàn)問(wèn)題有哪些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！1、載體構(gòu)建錯(cuò)誤，很多克隆新人常常弄錯(cuò)讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體，其復(fù)制位點(diǎn)常有一兩個(gè)堿基的差異；另外有些酶產(chǎn)生粘端有些酶產(chǎn)生平端，這些都容易導(dǎo)致讀碼框錯(cuò)誤，從而無(wú)法表達(dá)出來(lái)。2、宿主菌選擇不當(dāng)。不同的宿主菌其基因型是不同的。有些經(jīng)過(guò)特殊修飾的載體，或者特殊用途的載體，或者有特殊啟動(dòng)子的載體，必須選擇適...

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PCR反應(yīng)體系包括什么

PCR是一種選擇性體外快速擴(kuò)增DNA片段的方法。在體外以類(lèi)似于細(xì)胞內(nèi)DNA的半保留復(fù)制過(guò)程，以擬擴(kuò)增的模板DNA分子，與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4種dNTP及適合的緩沖體系組成的反應(yīng)體系，經(jīng)過(guò)重復(fù)地變性一退火一延伸三步，擴(kuò)增新的目的DNA鏈，這個(gè)過(guò)程通過(guò)控制反應(yīng)體系的溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)。那么你知道PCR反應(yīng)體系包括什么嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！一、模板(template)模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來(lái)源DNA(如基因組DNA、質(zhì)粒DNA等)或RNA(如總RNA、...

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為什么qPCR提RNA不提DNA

定量PCR（qPCR）是一種在PCR反應(yīng)中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。為什么qPCR提RNA不提DNA？RNA更能反映gene的表達(dá)水平依據(jù)中心法則，細(xì)胞內(nèi)的DNA序列首先被轉(zhuǎn)錄成RNA分子，特別是信使RNA（mRNA），隨后mRNA攜帶遺傳信息，用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。mRNA的豐度和多樣性是衡量基因表達(dá)水平的關(guān)鍵指標(biāo)，它們直接關(guān)聯(lián)到特定基因在特定時(shí)間和條件下的活性。與蛋白質(zhì)相比，RNA的水平變化能夠更快地反映基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，因?yàn)镽NA的穩(wěn)定性相對(duì)較低，其水平變化可以迅速...

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RNA和WB蛋白的關(guān)系是怎樣的？

qRT-PCR（定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）和Westernblot（蛋白質(zhì)印跡法）是兩種常用的生物分子檢測(cè)技術(shù)，它們分別用于檢測(cè)mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。雖然蛋白質(zhì)是由mRNA翻譯而來(lái)，但mRNA的表達(dá)水平總是與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平一致嗎？做實(shí)驗(yàn)任何一個(gè)結(jié)果如果你驗(yàn)證了幾遍都是一樣，那么請(qǐng)不要懷疑自己，也許不是你做錯(cuò)了，試圖去解釋這種現(xiàn)象!蛋白表達(dá)和RNA水平不一致的原因有：轉(zhuǎn)錄后調(diào)控：mRNA在轉(zhuǎn)錄后可以經(jīng)歷多種調(diào)控過(guò)程，如剪接、編輯、降解和穩(wěn)定性調(diào)控。這些過(guò)程可以影響mRNA...

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加藥處理的細(xì)胞如何換液？

加藥處理的細(xì)胞換液，需要遵循一定的操作步驟，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無(wú)菌以及細(xì)胞的健康生長(zhǎng)。以下是換液的一般步驟：1換液時(shí)間：一般建議每24或者48小時(shí)換液一次。2準(zhǔn)備新的培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和生長(zhǎng)需求，選擇合適的培養(yǎng)基。確保培養(yǎng)基新鮮、無(wú)菌，并在使用前預(yù)熱至37℃。收集舊培養(yǎng)基：輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使舊培養(yǎng)基充分混合。使用移液器將舊培養(yǎng)基收集到廢液缸。注意不要觸碰到細(xì)胞表面。3添加新培養(yǎng)基：將收集到的舊培養(yǎng)基丟棄，向培養(yǎng)瓶中加入新的培養(yǎng)基。確保新的培養(yǎng)基充分覆蓋細(xì)胞表面，避免氣泡產(chǎn)生，也...

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